IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) ເປັນສານປະສົມຂອງ β-galactosidase substrate, ເຊິ່ງສາມາດກະຕຸ້ນໄດ້ສູງ. ພາຍໃຕ້ການກະຕຸ້ນຂອງ IPTG, ຕົວກະຕຸ້ນສາມາດສ້າງສະລັບສັບຊ້ອນກັບໂປຣຕີນ repressor, ດັ່ງນັ້ນຮູບຮ່າງຂອງໂປຣຕີນ repressor ຈຶ່ງມີການປ່ຽນແປງ, ດັ່ງນັ້ນມັນຈຶ່ງບໍ່ສາມາດລວມກັບ gene ເປົ້າໝາຍໄດ້, ແລະ gene ເປົ້າໝາຍຈະຖືກສະແດງອອກຢ່າງມີປະສິດທິພາບ. ດັ່ງນັ້ນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ IPTG ຄວນຖືກກຳນົດແນວໃດໃນລະຫວ່າງການທົດລອງ? ໃຫຍ່ກວ່າດີກວ່າບໍ?
ກ່ອນອື່ນໝົດ, ໃຫ້ພວກເຮົາເຂົ້າໃຈຫຼັກການຂອງການກະຕຸ້ນ IPTG: lactose operon (ອົງປະກອບ) ຂອງ E. coli ປະກອບດ້ວຍສາມ gene ໂຄງສ້າງຄື Z, Y, ແລະ A, ເຊິ່ງເຂົ້າລະຫັດ β-galactosidase, permease, ແລະ acetyltransferase ຕາມລໍາດັບ. lacZ hydrolyzes lactose ເປັນ glucose ແລະ galactose, ຫຼືເປັນ allo-lactose; lacY ອະນຸຍາດໃຫ້ lactose ໃນສະພາບແວດລ້ອມຜ່ານເຍື່ອຫຸ້ມເຊວ ແລະ ເຂົ້າໄປໃນເຊວ; lacA ໂອນກຸ່ມ acetyl ຈາກ acetyl-CoA ໄປຫາ β-galactoside, ເຊິ່ງກ່ຽວຂ້ອງກັບການກຳຈັດຜົນກະທົບທີ່ເປັນພິດ. ນອກຈາກນັ້ນ, ຍັງມີລໍາດັບການດໍາເນີນງານ O, ລໍາດັບເລີ່ມຕົ້ນ P ແລະ gene ຄວບຄຸມ I. ລະຫັດ gene I ແມ່ນໂປຣຕີນ repressor ທີ່ສາມາດຜູກມັດກັບຕໍາແຫນ່ງ O ຂອງລໍາດັບປະຕິບັດການ, ດັ່ງນັ້ນ operon (meta) ຖືກສະກັດກັ້ນ ແລະ ປິດ. ຍັງມີບ່ອນຜູກມັດສໍາລັບບ່ອນຜູກມັດ protein-CAP ຂອງຕົວກະຕຸ້ນ gene catabolic ທີ່ຢູ່ທາງເທິງຂອງລໍາດັບເລີ່ມຕົ້ນ P. ລໍາດັບ P, ລໍາດັບ O ແລະ ບ່ອນຜູກມັດ CAP ຮ່ວມກັນປະກອບເປັນພາກພື້ນຄວບຄຸມຂອງ lac operon. ພັນທຸກໍາທີ່ເຂົ້າລະຫັດຂອງເອນໄຊມ໌ທັງສາມແມ່ນຖືກຄວບຄຸມໂດຍພາກພື້ນຄວບຄຸມດຽວກັນເພື່ອໃຫ້ບັນລຸການສະແດງອອກທີ່ປະສານງານຂອງຜະລິດຕະພັນພັນທຸກໍາ.
ໃນເວລາທີ່ບໍ່ມີ lactose, lac operon (meta) ຢູ່ໃນສະພາບທີ່ຖືກກົດຂີ່. ໃນເວລານີ້, lac repressor ທີ່ສະແດງອອກໂດຍລໍາດັບ I ພາຍໃຕ້ການຄວບຄຸມຂອງລໍາດັບ promoter PI ຈະຜູກມັດກັບລໍາດັບ O, ເຊິ່ງປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ RNA polymerase ຜູກມັດກັບລໍາດັບ P ແລະຍັບຍັ້ງການເລີ່ມຕົ້ນການຖອດລະຫັດ; ເມື່ອ lactose ມີຢູ່, lac operon (meta) ສາມາດກະຕຸ້ນໄດ້. ໃນລະບົບ operon (meta) ນີ້, ຕົວກະຕຸ້ນທີ່ແທ້ຈິງບໍ່ແມ່ນ lactose ເອງ. lactose ເຂົ້າໄປໃນຈຸລັງ ແລະຖືກກະຕຸ້ນໂດຍ β-galactosidase ເພື່ອປ່ຽນເປັນ allolactose. ອັນສຸດທ້າຍ, ໃນຖານະເປັນໂມເລກຸນຕົວກະຕຸ້ນ, ຈະຜູກມັດກັບໂປຣຕີນ repressor ແລະປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງໂປຣຕີນ, ເຊິ່ງນໍາໄປສູ່ການແຍກຕົວຂອງໂປຣຕີນ repressor ຈາກລໍາດັບ O ແລະ transcription. Isopropylthiogalactoside (IPTG) ມີຜົນກະທົບຄືກັນກັບ allolactose. ມັນເປັນຕົວກະຕຸ້ນທີ່ມີປະສິດທິພາບຫຼາຍ, ເຊິ່ງບໍ່ໄດ້ຖືກເຜົາຜານໂດຍເຊື້ອແບັກທີເຣຍ ແລະມີຄວາມໝັ້ນຄົງຫຼາຍ, ສະນັ້ນມັນຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນຫ້ອງທົດລອງ.
ວິທີການກໍານົດຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ດີທີ່ສຸດຂອງ IPTG? ຍົກຕົວຢ່າງ E. coli.
ເຊື້ອແບັກທີເຣຍ E. coli BL21 ທີ່ໄດ້ຮັບວິສະວະກຳທາງພັນທຸກຳທີ່ມີ pGEX (CGRP/msCT) ທີ່ເປັນບວກໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນສື່ກາງຂອງແຫຼວ LB ທີ່ມີ 50μg·mL-1 Amp, ແລະ เพาะเลี้ยงຄ້າງຄືນທີ່ອຸນຫະພູມ 37°C. ເຊື້ອແບັກທີເຣຍຂ້າງເທິງນີ້ໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນສື່ກາງຂອງແຫຼວ LB ສົດ 50mL ທີ່ມີ 50μg·mL-1 Amp ໃນອັດຕາສ່ວນ 1:100 ສຳລັບການเพาะเลี้ยงຂະຫຍາຍ, ແລະ ເມື່ອຄ່າ OD600 ແມ່ນ 0.6~0.8, IPTG ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍ. ມັນແມ່ນ 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. ຫຼັງຈາກການກະຕຸ້ນໃນອຸນຫະພູມດຽວກັນ ແລະ ໃນເວລາດຽວກັນ, ສານລະລາຍແບັກທີເຣຍ 1 mL ໄດ້ຖືກເອົາມາຈາກມັນ, ແລະ ຈຸລັງແບັກທີເຣຍໄດ້ຖືກເກັບກຳໂດຍການປั่นແຍກ ແລະ ຖືກນຳໄປໃຊ້ SDS-PAGE ເພື່ອວິເຄາະອິດທິພົນຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ IPTG ທີ່ແຕກຕ່າງກັນຕໍ່ການສະແດງອອກຂອງໂປຣຕີນ, ແລະ ຈາກນັ້ນເລືອກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ IPTG ທີ່ມີການສະແດງອອກຂອງໂປຣຕີນທີ່ໃຫຍ່ທີ່ສຸດ.
ຫຼັງຈາກການທົດລອງ, ຈະພົບວ່າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ IPTG ບໍ່ຫຼາຍເທົ່າທີ່ຈະຫຼາຍໄດ້. ນີ້ແມ່ນຍ້ອນວ່າ IPTG ມີຄວາມເປັນພິດຕໍ່ເຊື້ອແບັກທີເຣຍ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນເກີນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຍັງຈະຂ້າເຊວ; ແລະໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວ, ພວກເຮົາຫວັງວ່າໂປຣຕີນທີ່ລະລາຍໃນເຊວຫຼາຍເທົ່າໃດກໍ່ຍິ່ງດີ, ແຕ່ໃນຫຼາຍໆກໍລະນີເມື່ອຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ IPTG ສູງເກີນໄປ, ປະລິມານຂອງໂປຣຕີນທີ່ລະລາຍຈະຖືກສ້າງຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ຮ່າງກາຍ, ແຕ່ປະລິມານຂອງໂປຣຕີນທີ່ລະລາຍຈະຫຼຸດລົງ. ດັ່ງນັ້ນ, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ IPTG ທີ່ເໝາະສົມທີ່ສຸດມັກຈະບໍ່ແມ່ນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ໃຫຍ່ກວ່າກໍ່ຍິ່ງດີ, ແຕ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ຕ່ຳກວ່າ.
ຈຸດປະສົງຂອງການກະຕຸ້ນ ແລະ ການປູກຝັງເຊື້ອພັນທຸກໍາທີ່ຖືກອອກແບບທາງພັນທຸກໍາແມ່ນເພື່ອເພີ່ມຜົນຜະລິດຂອງໂປຣຕີນເປົ້າໝາຍ ແລະ ຫຼຸດຜ່ອນຕົ້ນທຶນ. ການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອພັນທຸກໍາເປົ້າໝາຍບໍ່ພຽງແຕ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຈາກປັດໃຈຂອງເຊື້ອພັນທຸກໍາເອງ ແລະ ພລາສມິດການສະແດງອອກເທົ່ານັ້ນ, ແຕ່ຍັງໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຈາກເງື່ອນໄຂພາຍນອກອື່ນໆ, ເຊັ່ນ: ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຕົວກະຕຸ້ນ, ອຸນຫະພູມການກະຕຸ້ນ ແລະ ເວລາການກະຕຸ້ນ. ດັ່ງນັ້ນ, ໂດຍທົ່ວໄປ, ກ່ອນທີ່ໂປຣຕີນທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກຈະຖືກສະແດງອອກ ແລະ ເຮັດໃຫ້ບໍລິສຸດ, ມັນດີທີ່ສຸດທີ່ຈະສຶກສາເວລາການກະຕຸ້ນ, ອຸນຫະພູມ ແລະ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ IPTG ເພື່ອເລືອກເງື່ອນໄຂທີ່ເໝາະສົມ ແລະ ໄດ້ຮັບຜົນການທົດລອງທີ່ດີທີ່ສຸດ.
ເວລາໂພສ: ວັນທີ 31 ທັນວາ 2021